近些年，藻類水華事件常有報道.其中，硅藻水華自1992年春季在我國漢江下游爆發(fā)后，幾乎每年春季漢江中下游江段均會暴發(fā)不同程度的水華.2005—2011年，嘉陵江流域間斷性爆發(fā)硅藻水華，70%~80%的藻類屬于針桿藻，水體渾濁，溶解氧降低，對水源質(zhì)量造成了巨大的破壞;且水廠出現(xiàn)硅藻嚴重堵塞濾池的現(xiàn)象，導(dǎo)致水處理量減小，出廠水質(zhì)變差.
目前除了常規(guī)的物理除藻方法，研究最多的是化學(xué)控藻技術(shù).Daly等研究銅綠微囊藻最高細胞密度為30×104 cells · mL-1時，氯作用在7～29 mg · min · L-1 之間(在水廠正常的消毒劑量范圍內(nèi))，所有藻細胞失活;但是已經(jīng)有大量的研究證明氯法殺藻會引起水中三鹵甲烷(THMs)等消毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生，因此該方法已經(jīng)正在逐漸被其他除藻藥劑代替.Chen等研究了高錳酸鉀預(yù)氧化能很好提高絮凝對藻去除率的機理，而Petrusěvski 等的研究也指出高錳酸鹽的使用劑量與殘余錳量是呈正相關(guān)的，因此發(fā)生水華時投加高錳酸鹽很有可能會造成水源中錳超標，硫酸銅的使用也有此類問題.劉海龍等用1.0 mg · L-1的臭氧預(yù)氧化使藻的去除率從常規(guī)混凝沉淀后水的55%~85%上升到95%左右，但高投加量(≥2.0 mg · L-1)的預(yù)氧化，會影響有機物的去除;Coral等研究直接使用臭氧作用于細胞密度為25×104和150×104 cells · mL-1 的銅綠微囊藻藻液，在作用CT值都小于0.2 mg · min · L-1 時，所有細胞即失活;可看出臭氧除藻的效果很好，但是存在的問題是制備臭氧的設(shè)備成本很高，在國內(nèi)很難應(yīng)用于實踐.Huang等從劑量、接觸時間和pH值等方面研究表明二氧化氯對藻的去除效果優(yōu)于或等同于液氯的去除效果;Zhou等研究將二氧化氯直接作用細胞密度為100×104 cells · mL-1銅綠微囊藻，在二氧化氯濃度1.0 mg · L-1作用10 min，藻細胞去除率達到91.5%.
目前我國關(guān)于除藻技術(shù)的研究以藍藻為主，較少有硅藻殺滅的研究，因此本文以硅藻門中的針桿藻為例，利用大氣壓強電離放電高效生成的· OH，注入到處理高藻水的主管路中，進行水華典型藻針桿藻的殺滅研究.采用以SYTOX Green熒光染色結(jié)合熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測藻細胞活性、光合活性參數(shù)Fv/Fm值分析藻細胞光合能力，這3種方法來確定· OH致死針桿藻的閾值濃度和閾值濃度下的致死時間.
2 材料和方法
2.1 實驗材料
藻種及培養(yǎng)：實驗所用的藻種購自中科院武漢水生所.針桿藻(FACHB-843，Synedra sp.)：屬硅藻門羽紋綱無殼縫目，細胞長桿形，長10 μm左右，殼面披針形，中部寬，從中間到兩端逐漸狹窄;色素體帶狀，位于細胞的兩側(cè)、片狀，2個，每個色素體常具有3個到多個蛋白核.培養(yǎng)基為Erdschreiber，培養(yǎng)條件為(25±1)℃，pH=7.0±0.1，光照2000 lx，光期 ∶ 暗期=12 ∶ 12.利用顯微鏡計數(shù)對藻細胞密度進行監(jiān)測，同時測吸光度，待進入對數(shù)生長期，進行實驗.
實驗用水是由純水機制備的去離子水，用于調(diào)節(jié)系統(tǒng)參數(shù)制備所需濃度的TRO溶液和配制藻液.
2.2 實驗系統(tǒng)
· OH處理高藻水的實驗系統(tǒng)如圖 1所示.待處理藻液由水泵泵入管路，進水流量為4 L · min2-1，純度為99.9%的O2通入氧等離子體發(fā)生器中(圖 2)，流量為0.5 L · min-1.在大氣壓下微流注與微輝光交替協(xié)同形成的強電離放電作用下，O2被電離，生成O+、O(21D)、O、O-、O2(a21Δg)、O3等氧活性粒子;然后在高壓射流器處，經(jīng)射流、空穴作用將氣態(tài)氧活性粒子高效傳質(zhì)混溶于水溶液中，生成以· OH為主的氧自由基溶液，其中還包括H2O2、HO-、O2· -，
圖1 · OH處理高藻水的實驗系統(tǒng)
圖2 等離子體發(fā)生器構(gòu)造圖
O2· -、HO3 ·和O2+H2O等自由基，將這些氧自由基統(tǒng)稱為總氧化劑TRO，使用在線檢測儀(ATi Q45H，美國)對管路中的TRO濃度進行測定.TRO溶液在管路中作用于藻細胞，進行快速高效地殺滅.管路中設(shè)置不同的取樣點，作用時間分別為1、2、3、4、5、6 s，以研究不同作用時間的殺滅效果.
2.3 檢測方法
2.3.1 總氧化劑TRO(Total
reactive oxidant)濃度檢測 TRO是以· OH為主，包括H2O2、HO2-、O23· -、O· -、HO3 ·和O2+H2O等氧自由基的總氧化劑，使用在線監(jiān)測儀(ATi Q45H，美國)對TRO濃度進行測定，同時使用DPD(N，N-二乙基對苯二胺)分光光度法對濃度進行校正，該方法根據(jù)USEPA標準330.5建立，使用紫外可見分光光度儀(Bioquest CE2501，英國)測定.
2.3.2 藻細胞活性分析
本實驗采用熒光染色法結(jié)合熒光顯微鏡計數(shù)和流式細胞儀來定量分析藻細胞活性，這些方法已廣泛應(yīng)用于分析細菌、胞子和藻細胞活性.熒光染料為SYTOX Green(Life Technologies，美國)核酸染色劑，當細胞膜受損，染色劑通過細胞膜進入細胞，與DNA結(jié)合，可在488 nm波長激發(fā)后發(fā)出綠色熒光;對于活細胞，染色劑不能通過細胞膜而不會被染色.
于暗室內(nèi)染色，使用熒光顯微鏡(Nikon 90i，日本)和0.100 mL 100格的藻類計數(shù)框(20 mm×20 mm)，進行觀察計數(shù).涂片靜置，放大400倍，分別在自然光和藍色激發(fā)光下觀察細胞，對沒有發(fā)出綠色熒光的完整細胞進行計數(shù).以1行(即10格)為1個計數(shù)單位進行計數(shù)，所計細胞數(shù)目≥100 cells.
于暗室內(nèi)染色，樣品經(jīng)流式細胞儀(Beckman Coulter Gallios，美國)488 nm的波長激發(fā)，細胞發(fā)出的熒光信號會分別被FL1(525 nm)和FL3(620 nm)通道收集.激發(fā)后發(fā)出的綠色熒光，在FL1通道被收集;同時細胞內(nèi)葉綠素發(fā)出的紅色熒光會被FL3通道收集.
2.3.3 藻細胞的光合能力分析
光合參數(shù)Fv/Fm值，表示藻細胞光合反應(yīng)中心PS II的最大光量子產(chǎn)量，反映了植物的最大潛在光合能力.該值越大說明光和潛力越大.樣品經(jīng)10 min的暗適應(yīng)，使用浮游植物熒光儀(PHYTO-PAM Walz，德國)和Photo win v2.13(ED)操作軟件測定.經(jīng)過充分暗適應(yīng)后，所有電子門均處于開放態(tài)，打開測量光得到最小熒光F0，此時給出一個飽和脈沖，所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了熒光和熱，此時得到的最大熒光Fm，根據(jù)Fm和F0可以計算出Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm.
3 結(jié)果與分析 3.1 采用熒光顯微鏡計數(shù)確定致死閾值
實驗中對初始藻密度分別為10×104、50×104、100×104 cells · mL-1的藻液在實驗系統(tǒng)中進行殺滅.對于某一藻密度的藻液，改變TRO濃度，利用熒光顯微鏡測定藻細胞的存活率(c/c0).得到不同初始藻密度的藻細胞存活率與TRO濃度的關(guān)系曲線，如圖 3所示.可看出，隨著TRO濃度的不斷升高，藻細胞存活率隨之降低;在相同的TRO濃度下，藻類的初始濃度越高，存活率越低.因此使不同的初始藻密度的藻細胞完全致死所需的TRO濃度是不同的.隨著藻液初始藻密度的升高，所需要的致死劑量也隨之升高.致死劑量由低到高分別為0.25、0.71、1.18 mg · L-1.
圖3 藻細胞存活率(c/c0)與TRO濃度的關(guān)系曲線
分析比較初始密度增大的倍數(shù)與對應(yīng)的TRO致死劑量增大的倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)TRO致死劑量增大的倍數(shù)均小于初始密度增大的倍數(shù).如初始藻密度10×104 cells · mL-1分別增大到5、10倍，而對應(yīng)的TRO致死劑量明顯小于5、10倍.推測溶液中· OH占總氧化劑的比例隨TRO濃度的增加而增加，從而導(dǎo)致所需的TRO劑量相對減少.
初始藻密度為100×104 cells · mL-1的藻液，在致死閾值下經(jīng)· OH處理.在顯微鏡下，放大400倍，分析處理前后藻細胞形態(tài)的變化.在自然光下，處理前，藻細胞通體周圓，細胞壁光滑完好，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分布清晰，顏色鮮亮稠密;處理后，藻細胞外形基本沒有變化，但顏色暗淡，胞內(nèi)分布模糊.在熒光下，處理前藻細胞發(fā)出紅色的葉綠素自體熒光，無綠色熒光;處理后細胞核發(fā)出強烈的綠色熒光，證明細胞失活，染色劑通過細胞膜進入細胞，與細胞核中的DNA結(jié)合，使細胞核染色.
以上現(xiàn)象均可看出在較低的致死閾值作用下，細胞失活后外形沒有大的變化，更沒有出現(xiàn)裂解.
3.2 采用光合能力確定致死閾值
作為一種自養(yǎng)型生物，硅藻需要自身的光合反應(yīng)系統(tǒng)，包括光合反應(yīng)系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光合反應(yīng)系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)完成能量轉(zhuǎn)換.這種脈沖式調(diào)制熒光測定技術(shù)(PAM)是基于測定葉綠素熒光的原理，是一種表征光合反應(yīng)系統(tǒng)的性能，特別是PSⅡ的活性的強有力的手段.對PSⅡ反應(yīng)中心的損傷不僅會引起光抑制作用，固碳作用受損和生長速率降低.目前已有研究表明利用該方法測得的Fv/Fm值可作為預(yù)測藻類生長趨勢的參數(shù).
初始細胞密度分別為10×104、50×104、100×104 cells · mL-1的藻液，測定經(jīng)過不同TRO濃度作用后藻液的光合參數(shù)Fv/Fm值，分析藻細胞光合能力的變化情況，處理前藻液的Fv/Fm值為0.50左右，處理后隨著TRO濃度的增大而減小，F(xiàn)v/Fm值降低為0，說明此時的藻細胞已經(jīng)不能進行光合作用，藻細胞已無生長能力.此時的TRO濃度即為致死閾值，分別為0.30、0.75、1.20 mg · L-1.
3.3 采用流式細胞技術(shù)確定致死閾值濃度
初始藻密度為100×104cells · mL-1，利用流式細胞儀分析不同TRO濃度與藻細胞致死情況的關(guān)系，橫坐標FL1-A對應(yīng)于染色劑與細胞核酸結(jié)合后發(fā)出的綠色熒光強度，縱坐標FL3-A對應(yīng)于葉綠素的自發(fā)紅色熒光強度.區(qū)域Q1的FL1信號較弱，而FL3信號較強，說明此區(qū)域為活細胞所在區(qū)域.比較對照組和處理組，細胞團由區(qū)域Q1逐漸向右下方即區(qū)域Q2和Q3移動，即綠色熒光增強，葉綠素熒光減弱.證明細胞失活，被SYTOX Green染色，同時葉綠素也遭到破壞.由對照組到TRO濃度依次增大為0.61、0.83、1.18 mg · L-1，區(qū)域Q1的活細胞占全部檢測細胞的比例由原始的93.6%依次減小為16.5%、1.21%、0.265%(圖 4a~d)，說明存活細胞隨TRO濃度的增大而減少.
3.4 · OH對針桿藻的致死時間探究
分別在致死閾值濃度0.30、0.75、1.20 mg · L-1時，將初始藻密度分別為10×104、50×104、100×104 cells · mL-1的針桿藻藻液通入殺藻實驗系統(tǒng)(圖 1).將高壓射流器處藻液與氧等離子體剛開始混合時，設(shè)為0 s，分別依次于不同作用時間(分別為1、2、3、4、5、6 s)的取樣口取樣，同時用過量的飽和硫代硫酸鈉終止反應(yīng).檢測每一樣品的Fv/Fm值，結(jié)果可看出，F(xiàn)v/Fm值均在1 s內(nèi)快速由0.50減小為0(儀器顯示為不能檢出).說明在高壓射流器處到1 s取樣口之間，發(fā)生了氧等離子體與水分子快速生成· OH并進行劇烈的生化反應(yīng).
3.5 討論
3.5.1 致死閾值的確定
分析3種確定致死閾值的方法，可知用熒光顯微鏡觀察計數(shù)比較直觀，可得到細胞存活數(shù)量，得到的結(jié)果比較穩(wěn)定可靠，致死閾值分別為0.25、0.71、1.18 mg · L-1;而通過光合參數(shù)Fv/Fm值的變化確定的致死閾值(0.30、0.75、1.20 mg · L-1)與顯微鏡計數(shù)確定的致死閾值相差很小，分別為0.05、0.04、0.02 mg · L-1，基本吻合;采用流式細胞儀分析處理前后不同通道接收的熒光強度的變化來確定致死閾值，這種方法存在的問題是，只能得到活細胞的百分比例，無法得知具體的數(shù)目，而且結(jié)果的準確度與分析者的熟練程度有很大關(guān)系.本實驗中初始藻密度為100×104 cells · mL-1，在致死閾值1.18 mg · L-1下，使用流式細胞儀分析后，仍有約2560 cells · mL-1的活細胞，由于實驗分析方法的局限，無法使致死率達到100%，因此該方法確定的致死閾值要大于使用計數(shù)法確定的致死閾值.
3.5.2 ·
OH對針桿藻的殺滅效果 本實驗中在致死閾值下，1 s內(nèi)使光合參數(shù)Fv/Fm由0.50減小為0，使100×104cells · mL-1藻液中的藻細胞失活的CT值約為0.02 mg · min · L-1，Li等(Li et al.， 2014)的研究水力空化作用1 min，產(chǎn)生· OH的濃度為(0.67±0.03)μmol · L-1，立即測定光合參數(shù)由0.33降低為0.31，變化很小;Ou等的研究結(jié)果為KMnO4作用2 h，光和潛力由0.45減低到0.07;Zhou等的研究結(jié)果為2.5 μmol · L-1(即0.4 mg · L-1)CuSO4及0.5 mmol · L-1(即17 mg · L-1)H2O2分別作用48 h后，光合參數(shù)分別由處理前約0.42減小為約0.05.Daly等利用流式細胞儀來定量分析氯對藻細胞的致死率，研究中也發(fā)現(xiàn)藻細胞數(shù)量增多，致死率達100%時的需氯量也隨之增加;氯作用的CT值在7 mg · min · L-1以上，可使30×104 cells · mL-1的銅綠微囊藻藻細胞完全致死;Zhou等的研究中發(fā)現(xiàn)可使100×104 cells · mL-1的銅綠微囊藻藻細胞在1 mg · L-1的二氧化氯作用10 min后(CT值約為10 mg · min · L-1)致死率達到91.5%.相比之下，本實驗條件下得到的反應(yīng)時間是其他普通氧化劑的1/60以下，CT值為其他氧化劑的1/100以下，說明· OH有強烈的氧化性和極高的氧化反應(yīng)速率，其氧化還原電位(2.8 V)接近氟的氧化還原電位，反應(yīng)無選擇性;而且反應(yīng)速率高達109 mol · L-1 · s-1，比其他氧化劑的高107倍，可使生化反應(yīng)在ms級內(nèi)進行.
4 結(jié)論
1)初始藻密度分別為10×104、50×104和100×104 cells · mL-1的藻液，采用熒光顯微鏡計數(shù)和光合能力的變化確定的致死閾值分別為0.25、0.71、1.18 mg · L-1及0.30、0.75、1.20 mg · L-1，分別相差0.05、0.04、0.02 mg · L-1，基本吻合.而采用流式細胞儀分析確定致死閾值時，無法使致死率達到100%，因此無法確定致死閾值.
2)在致死閾值下，光合參數(shù)Fv/Fm值1 s內(nèi)減小為0，藻細胞喪失光合能力和生長潛力.
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